我做的实验是提取总的RNA,然后反转录,再PCR,最后出来的结果是这样的见图,我的目的条带为500bp我的条带为一片，没有特意性的

我做的实验是提取总的RNA,然后反转录,再PCR,最后出来的结果是这样的见图,我的目的条带为500bp我的条带为一片，没有特意性的
我做的实验是提取总的RNA,然后反转录,再PCR,最后出来的结果是这样的见图,我的目的条带为500bp
我的条带为一片，没有特意性的

我做的实验是提取总的RNA,然后反转录,再PCR,最后出来的结果是这样的见图,我的目的条带为500bp我的条带为一片，没有特意性的
这就是特异性不好,建议做如下改进：
1,控制好RNA提取过程,尽量减少RNA降解和基因组DNA的混入；
2,严重怀疑你的模板量过高,把模板稀释10-1000倍的梯度试试；
3,做二阶段温度pcr,先用稍高退火温度p上5循环,剩余的再用你现在的温度,或者有梯度pcr仪的话,做梯度pcr；
4,如果镁离子浓度较高,可稍降镁离子浓度.
欢迎继续讨论,纯属手打,祝实验顺利!

图呢？

没图没真相

你首先需要知道你要克隆什么基因，看看水稻中有没有人做出来，如果没有就找水稻基因组已经解决，根据你要调出来的序列去blast找到全序列，然后根据其5‘

可能是引物特异性不好吧。有没有试过最佳温度？

拿提完RNA跑个凝胶电泳，检验提取的RNA的浓度纯度及完整性

1.cDNA产量的很低
A: RNA模板质量低
B: 对mRNA浓度估计过高
C: 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
D: 反应体积过大
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
A: 最常见的原因在于反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
　　 B: 与反应起始时RNA的总量及纯度有关
　　 C: ...

全部展开

1.cDNA产量的很低
A: RNA模板质量低
B: 对mRNA浓度估计过高
C: 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
D: 反应体积过大
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
A: 最常见的原因在于反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
　　 B: 与反应起始时RNA的总量及纯度有关
　　 C: 建议在试验中加入对照RNA
　　 D: 第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
　　 E: 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反 转录酶无法从此引物进行有效延伸。目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决.
　　 a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
　　 b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应
3. 产生非特异性条带
A: 用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
B: 在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
C: 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
4. 产生弥散(smear)条带
A: 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高
　　 B: 减少引物的用量
　　 C: 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数
　　 D: 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带
大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10(或1:100-1:200)
6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果
A: 通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。
B: 有可能是引物二聚体的条带
7. 扩增产物滞留在加样孔中
A: 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。B: 建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。
C: 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

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